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陈鹏课题组发现甲醛“激活”蛋白质的独特化学修饰



作为生活中的常见致癌物,甲醛会对人体产生很大危害。但另一方面,生物体本身产生一定的甲醛。这些“内源”甲醛分子多条生理代谢途径的原料或产物细胞的存活与生长密切相关有研究显示作为一碳化合物,甲醛能够被纳入碳循环(one-carbon-cycle),用于DNA必需氨基酸的合成Burgos-Barragan, G. et al. Nature, 2017, 548, 549–554虽然甲醛这些生理功能逐渐揭示与甲醛相关的许多疑问仍有待探索。例如,细胞是通过何种机制来特异识别和感知内源甲醛浓度?甲醛对应的信号是如何在细胞内传递产生响应,避免甲醛造成的损伤?们又能否对细胞内的甲醛动态分布进行精准探测,揭示甲醛的生理功能呢

针对上述问题,365体育娱乐官网365体育娱乐官网、365娱乐游戏-清华生命科学联合中心陈鹏课题组着手对一个独特的甲醛响应的转录因子HxlR进行了深入研究首次从结构与化学机理上揭示了甲醛诱导HxlR蛋白发生分子内交联反应所产生的“亚甲基桥”methylene bridge)这一特殊化学修饰使HxlR产生功能获得性gain-of-function生理响应基于这一发现他们开发了首个遗传编码的甲醛荧光探针(FAsor,成功应用于检测活细胞以及小鼠脑组织切片中甲醛的动态变化相关成果于2021125在线发表《自然-通讯》杂志(Nature Communications“Genetically encoded formaldehyde sensors inspired by a protein intra-helical crosslinking reaction” DOI10.1038/s41467-020-20754-4

甲醛生物学和化学领域的研究者来说并不陌生如果思考这样一个问题甲醛与蛋白质会发生什么化学反应答案可能是,能够与蛋白质上的亲核氨基酸侧链发生加成反应甲醛作为蛋白质交联试剂,能够在蛋白质的亲核残基(赖氨酸)之间形成交联使蛋白质变性失活然而,甲醛使蛋白质变性的原因不能细胞响应甲醛的机制划等号首先使蛋白质变性的甲醛浓度远高于细胞内源甲醛的浓度范围;其次甲醛使蛋白质变性是一种非特异性的、损伤性的过程这很难作为细胞精确响应和调控生理水平甲醛工作机制因此,甲醛在细胞中有哪些特异性的响应模式这些响应是通过什么样的分子机制实现的,仍是一个未知的问题。枯草芽孢杆菌发现HxlR蛋白是一种转录激活因子能够在甲醛刺激下激活下游基因转录,进行功能获得性(gain-of-function)的生理响应Yurimoto, H. et al. Mol. Microbiol., 2005, 57, 511–519HxlR这一特性吸引研究团队选择HxlR蛋白以探究特异响应甲醛分子的机制

首先,为了确认HxlR蛋白直接与甲醛发生了化学反应,研究团队结合质谱分析与X射线晶体学研究HxlR与甲醛的相互作用HxlR与甲醛共孵育的质谱分析显示甲醛能够使HxlR发生+12 Da的分子量偏移。这一变化甲醛诱导的亚甲基桥一致,说明HxlR很有可能直接与甲醛发生反应。进一步的二级质谱肽段鉴定,以及HxlR-甲醛共晶结构解析共同佐证了这一点。两者的结果均显示,与甲醛反应之后,位于HxlR蛋白N第一个α螺旋半胱氨酸(Cys11赖氨酸(Lys13残基之间形成了位点特异的“亚甲基桥”针对这一发现,研究团队又通过位点突变来确认交联反应与HxlR蛋白功能的联系结果显示,无论突变哪一个位点(C11AK13A),HxlR都将失去响应甲醛的能力。这说明HxlR蛋白的确通过Cys11Lys13特异性识别甲醛,形成亚甲基桥这一独特的化学修饰,实现转录功能的激活

甲醛HxlR蛋白位点特异性反应形成分子内亚甲基桥

那么甲醛诱导的分子内交联又是如何实现对HxlR蛋白功能的激活研究团队接下来仔细分析了不同处理条件与突变体的HxlR蛋白晶体结构通过对甲醛处理前后HxlR结构对比他们发现看似简单的亚甲基桥却引起了蛋白整体构象的极大变化!甲醛诱导的Cys11-Lys13亚甲基桥迫使原本位于同一α螺旋两侧的个氨基酸侧链相互靠近,扭曲α螺旋结构,并“牵一发而动全身”,带动HxlR蛋白N端主链朝向翻转(N-terminal flipping),使得蛋白整体构象发生改变极大地增强HxlR蛋白DNA的结合能力激活下游基因的转录至此,研究团队揭示HxlR特异性响应甲醛并发生结构与功能转换的分子机制

甲醛通过位点特异的亚甲基桥连激活转录因子HxlR

这一甲醛响应机制的解析进一步研究团队提供了启示HxlR特异性响应甲醛的构象变化可以用于设计甲醛检测荧光探针。目前已报道的甲醛探针均为小分子探针,时空分辨率与细胞、组织特异性受到限制,难以对甲醛的细胞内分布进行精确检测。基因编码的荧光探针,在时空分辨的检测、动态检测方面都更有优势,但鉴于甲醛响应机制研究的缺乏,难以设计基于蛋白质的探针HxlR蛋白相应甲醛的分子机制的解析无疑为这一问题提供了解决方案。

基于对HxlR蛋白的结构分析,研究团队向HxlR特定位点嵌入了对结构变化敏感的荧光蛋白,并通过筛选和优化,成功开发出一系列新型基因编码的甲醛荧光探针。他们首先在体外实验中对探针进行了表征。之后,研究团队利用该探针,成功进行细胞内甲醛浓度的动态检测;通过多色荧光成像,对不同亚细胞空间甲醛变化进行了同步检测通过干扰甲醛代谢通路,记录了探针对胞内甲醛生理浓度变化的响应进一步,研究团队与365体育娱乐官网李毓龙课题组合作,检测了该探针在小鼠脑组织切片对甲醛的动态响应验证了该探针具有动物组织水平的应用潜力

基于甲醛响应转录因子HxlR蛋白新型甲醛探针

 综上,该工作实现了甲醛响应蛋白HxlR机制解析发现了甲醛诱导HxlR产生独特化学修饰,并由亚甲基引起构象变化和激活转录调控的分子机制受此启发,研究团队进一步开发了首个遗传编码的甲醛探针为研究细胞内源甲醛的调控与功能提供了重要工具

需要指出的是,本研究发现的“分子内交联”这一独特的化学修饰,可能与蛋白酰基化、烷基化等翻译后修饰类似,能够调控蛋白质的活性与功能例如近有研究显示,糖酵解通路的中间产物丙酮醛,可以对细胞氧化应激通路蛋白KEAP1进行“分子内交联”修饰,在邻近的精氨酸Arg)与半胱氨酸Cys)之间产生交联,启动下游应激响应Bollong, M. et al. Nature, 2018, 562, 600604可以预见,“分子内交联”修饰种类、性质与功能值得进一步探索。

 陈鹏课题组2012级博士毕业生祝融峰、张功为共同第一作者365体育娱乐官网生命科学学院生命科学联合中心李毓龙教授及其课题组2012级博士毕业生井淼完成动物实验关键数据该工作得到了国家自然科学基金委、科技部、北京分子科学国家研究中心以及365娱乐游戏-清华生命科学联合中心的资助。

论文链接:https://www.nature.com/articles/s41467-020-20754-4

 

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